ICS 67.100.10
X 04
GB/T 18980-2003
乳和乳粉中黃曲霉毒素M,的測定
免疫親和層析凈化液相色譜法
和 熒 光 光 度 法
Determination of aflatoxin M1 content in milk and milk powder-
Cleanup by immunoaffinity chromatogaphy and determination by
hig h- pe rformancel iquidc hromatigraphya ndf luorometer
(ISO 14501:1998，IDT)
2003-02-21發布2003-08-01實施
中華人民共和國
國家質量監督檢驗檢疫總局發布
GB/T 18980-2003
前言
本標 準 的 免疫親和層析凈化一液相色譜法等同采用ISO1 4501;1998《乳和乳粉中黃曲霉毒素
M 免疫親和層析凈化液相色譜法》。
本標 準 免 疫親和層析凈化一熒光光度法快速測定乳和乳粉中黃曲霉毒素M,o
本標 準 中 的附錄A為資料性附錄
本標 準 由 北京市質量技術監督局提出。
本標 準 由 全國食品工業標準化技術委員會歸口。
本標 準 起 草單位:北京市產品質量監督檢驗所、青島出人境檢驗檢疫局、國家標準物質研究中心。
本標 準 主 要起草人:王晶、張鵬、張藝兵、邵明武。
本標 準 為 發布。
GB/T 18980-2003
乳和乳粉中黃曲霉毒素M,的測定
免疫親和層析凈化液相色譜法
和熒 光 光 度 法
免疫親和層析凈化液相色譜法
1. 1 范圍
本標 準 適 用于乳、乳粉，以及低脂乳、脫脂乳、低脂乳粉和脫脂乳粉中黃曲霉毒素M,含量的測定。
乳粉中的zui低檢測限是。.08 pg/kg，乳中的zui低檢測限是。.008 pg/l
1.2 術語和定義
下列 術 語 和定義適用于本標準。
1.2. 1
黃曲 碑 毒 索M，含， at7atoxinM ,co ntent
通過 本 標 準所測定出的本物質的質量含量。
注 :黃 曲 霉毒素M、的含量以微克/升伽g/L)或微克/千克(fig/kg)表示。
1. 3 原理
試樣 通 過 免疫親和柱時，黃曲霉毒素M 被提取。親和柱內含有的黃曲霉毒素M、特異性單克隆
抗體交聯在固體支持物上，當樣品通過親和柱時，抗體選擇性的與黃曲霉毒素M,(抗原)鍵合，形成抗
體一抗原復合體。用水洗柱除去柱內雜質，然后用洗脫劑洗脫吸附在柱上的黃曲霉毒素M,，收集洗脫
液。用帶有熒光檢測器的液相色譜儀測定洗脫液中黃曲霉毒素M,含量
1.4 試荊
除非 特 別 聲明，所用試劑為分析純;使用蒸餾水、去離子水或其他相當純度的水。
1.4.1 免疫親和柱:應該含有黃曲霉毒素M 的抗體。親和柱的zui大容量不小于100 ng黃曲霉毒素
M,(相當于50 ml濃度為2 pg/l的試樣)，當標準溶液含有4 ng黃曲霉毒素M,(相當于50 mL濃度為
80 ng/l的試樣)時回收率不低于80 。應該定期檢查親和柱的柱效和回收率，對于每個批次的親和柱
至少檢查一次(見1.4.1.1和1.4.1.2)
1.4.1.1 柱效檢查
用移 液 管 (1.5.4)移取1.0m 工_的黃曲霉毒素M,儲備液(1.4.5.2)到20m L的錐形試管中
(1.5.9)。用恒流的氮氣(1.4.3)將液體慢慢吹干，然后用10 ml. 10%的乙睛(1.4. 2.2)溶解殘渣，用力
搖蕩。
將該 溶 液 加人到40m L的水中，充分混勻，全部通過免疫親和柱。按說明書要求使用免疫親和柱。
淋洗免疫親和柱后，洗脫下黃曲霉毒素M,。將洗脫液進行適當稀釋后，用液相色譜儀測定免疫親
和柱鍵合的黃曲霉毒素M,含量。
計算 黃 曲 霉毒素M,的回收率，將其結果與1.4.1中所要求的指標進行比較。
1.4.1.2 回收率檢查
用移 液 管 (1.5們移取。.8 m l。005p g/ml的黃曲霉毒素Ml標準工作液(1.4.5.3)到10m L的
水中，充分混勻，全部通過免疫親和柱。按說明書使用免疫親和柱。淋洗免疫親和柱，洗脫下黃曲霉毒
素M:。將洗脫液進行適當稀釋后，用液相色譜儀測定免疫親和柱鍵合的黃曲霉毒素M，含量。計
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算黃曲霉毒素M，的回收率，將其結果與1.4. 1中所要求的指標進行對比。
1.4.2 乙睛:色譜級
1.4.2.1 25%乙睛一水溶液:將250m L的乙睛(1.4.2)與750m l的水混溶(使用前需要脫氣)。
1.4.2.2 10%乙睛一水溶液:將100m L的乙睛(1.4.2)與900m L的水混溶(使用前需要脫氣)。
1.4.3 氮氣。
1.4.4 三抓甲烷:加人。.5%^-1.0%質量比(與三抓甲烷質量比)的乙醇進行穩定。
1.4.5 黃曲霉毒素M:標準溶液
1.4.5. 1 校準溶液
黃曲 霉 毒 素M:三抓甲烷溶液標稱濃度為10p g/mL。根據下面的方法，在zui大吸收波段處測定溶
液的吸光度，以確定黃曲霉毒素M,的實際濃度。
用分 光 光 度計(1.5.11)在340n m^-370n m處測定，扣除三抓甲烷的空白本底，讀取標準溶液的吸
光度值。在接近360 nmzui大吸收波段A、二處，測得吸光度值為A，根據式(1)計算出濃度值
c, (Pg/mL),
..
‘ = A X M X 1 00 /e · ··· ··· ·· ·· ··· ··· ··· ··· ··· ··· · ··· ·? ? ( 1 )
式 中 :
A— 在 3m.:處測得的吸光度值;
M- - 32 8g /mol，黃曲霉毒素M,摩爾質量，單位為克每摩爾(g/mol);
E- 19 95,溶于三抓甲烷中的黃曲霉毒素M,的吸光系數，單位為平方米每摩爾(m'/m ol),
1.4.5.2 標準儲備液
確定 黃 曲 霉毒素M;標準溶液的實際濃度值后(1.4.5.)1，繼續用三抓甲烷將其稀釋至濃度為
0.1 u g/mI一的儲備液。儲備液密封后于冰箱中5℃以下避光保存。在此條件下，儲備液可以穩定兩個
月。兩個月后，應該對儲備液的穩定性進行核查。
1.4.5.3 黃曲霉毒素M,標準工作液
從冰 箱 中 取出儲備液(1.4.5.2)放置至室溫，移取一定量的儲備液進行稀釋制備成工作液。工作液
當天使用當天制備。
黃曲 霉 毒 素M，標準工作液配制:用移液管(1.5. 4) 準確移取1.0 m L的儲備液(1.4. 5. 2)到20m L
的錐形試管中(1.5.9)，用和緩的氮氣(1.4.3)將溶液吹干，然后用20.0 m L1 0%的乙睛(1.4.2.2)將殘
渣重新溶解，30m in內振搖、混勻，配成濃度為。.00 5j g/mI的黃曲霉毒素M;標準工作液。在用氮氣
對儲備液吹干的過程中，一定要仔細操作，不能讓溫度降低太多而出現結露。
在作 標 準 曲線時，黃曲霉毒素M，的進樣量分別為。.05n g,0.1 n g,0.2 n g和。.4 n g。根據液
相色譜儀進樣環的容積量，用工作液配制一系列適當濃度的黃曲霉毒素M,標準溶液，稀釋液用10%乙
睛(1.4.2.2)
5 儀骼及材料
便用 實驗室通用儀器設備，特殊儀器及材料說明如下
1,5. 1
1.5.2
1.5.3
1.5.4
1.5.5
1.5.6
1.5.7
1.5.8
1.5.9
1.5. 10
一次性注射器:10 mL和50 mL,
真空系統。
離心機:40 00g 離心力(離心力g=1.12 X 1 0-,X 轉/分X旋轉半徑)。
移液管:1.0m L,2.0 m l和50.0 M L,
玻璃燒杯:250 mLo
容量瓶:100 mLe
水浴
濾紙
:溫控30℃士2',50℃士20C,溫度范圍350C---370C,
帶刻度的磨口錐形玻璃試管:5 mL,10 mL,20 mI。
液相色譜儀
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1.5. 10.1 無脈沖泵:適合恒定體積流量約1 mL/min的泵
1.5. 10.2 進樣系統:具有固定或可變容積的進樣環，進樣體積50川--500 pL.
1.5. 10.3 反相色譜柱:填充3 um或者5 km的十八烷基硅膠，加有填充反相材料的保護柱。
1.5. 10 .4 熒光檢測器:具有365n m激發波長、435n m發射波長，在適當的色譜條件下能夠測定
0. 02 ng的黃曲霉毒素M,(相當于5倍噪音)。
1.5. 10.5 記錄儀:帶打印機或繪圖儀、電子積分儀或計算機數據處理系統。
1.5. 1 1 分光光度計:波長范圍為200n m--400n m，帶光徑長度為1c m的石英比色池。
1.5. 12 天平:準確至。.1g，zui小分度。.01 go
1.6 采樣
采樣 方 法 不屬于本標準敘述的范圍，推薦的采樣方法請參見ISO7 07[1]a
實驗 室 收 到的樣品應該具有真正的代表性，在運輸和儲藏的過程中沒有被損壞和改變。
1.7 分析步驟
1.7. 1 概述
所有 的操 作分析均應盡可能在避光條件下進行。
使用 不 同 廠商的親和柱，在乳粉的制作、洗滌和洗脫的操作方面可能略有不同，應該嚴格按照說明
書要求進行操作。通常的分析步驟包括:用水或者鹽水緩沖液將乳粉沖制成乳，離心分離后在一定壓力
過柱(可能需要預洗)，用水洗柱，并用甲醇或乙睛洗脫吸附在柱上黃曲霉毒素M,。嚴格按照規定的流
速進行操作。
1.7.2 制備試樣
1.7.2. 1 乳
將乳 樣 品 在水浴(1.5 .7) 中加熱到350C-370C。用濾紙(1.5.8)過濾(根據情況，也許需要用幾張
濾紙進行過濾)，或者在4 000 g離心力下離心15 min。至少收集50 mL乳試樣，按照1.7.4繼續進行
分析。
1.7.2.2 乳粉
稱取 10 g樣品(到0.1 g ),置于250m L的燒杯(1.5.5)中。將50m L已預熱到50℃的水多次
少量地加人到乳粉中，用攪拌棒將其混合均勻。
如果 乳 粉 不能*溶解，將燒杯在50℃的水浴(1.5. 7)中放置至少30m in，仔細混勻。
將溶 解 的 乳粉冷卻至20℃后，移人100m l容量瓶(1.5.6 ) 中，用少量的水分次淋洗燒杯，淋洗液一
并移人容量瓶中，再用水定容至刻度。用濾紙(1.5.8)過濾乳，或者在4 000 g離心力下離心15 min,
至少收集50 ml_的乳試樣，按照1.7.4繼續進行分析。
1.7.3 免疫親和柱的準備
將一 次 性 的50m L注射器筒(1.5.1)與親和柱(1.4.1)的頂部相連，再將親和柱與真空系統
(1.5.2)連接起來。
，.7.4 樣品的提取與純化
用移 液 管 移取50m L試樣(1.7.2.1或1.7.2.2)到50m L注射器(1.5.1)中，調節真空系統
(1.5.2),控制試樣以Zm工一min-3 ML/min穩定的流速過柱。
取下 50 M I的注射器，裝上10m L注射器。注射器內加人10M I水，以穩定的流速洗柱，然后，抽
干親和柱。
脫 開真 空 系統，裝上另一個10m L注射器，加人4m L乙睛(1.4.2),緩緩推動注射器栓塞，通過柱
塞控制流速，洗脫黃曲霉毒素M,，洗脫液收集在錐形管(1.5.9)中，洗脫時間不少于60 s。然后用和緩
的氮氣(1.4.3)在30℃下將洗脫液蒸發至體積V。為50 1,L-500 pL(警告:如果蒸發至干，會損失黃曲
霉毒素M,)。用水將V。稀釋10倍至zui終體積為V,(即500 pL-5 000 VI)。
注:如果注人液相色譜儀含黃曲霉毒素M 的樣品，乙睛含量超過10腸，色譜峰變寬。如果水含量超過90%
則 對 色 譜峰的形狀沒有影響。
cs/T 18980-2003
1.7.5 液相色譜分析儀
1. 7.5.1 泵
以t ra定 流 速 將 乙睛一水溶液(1.4.2.1)泵流通過液相色潛柱。如果需要(根據所用色譜柱的型
號)，調整乙睛一水的比例，以保證使黃曲霉毒素M,與其他成分的分離效果*。
乙睛 水 溶 液 (1.4.2.1)的體積流速根據所用色譜柱(1.5. 10 .3 ) 而定對于普通色譜柱(柱長約
25 cm,柱內徑約4. 6 mm)而言，流速在1 ml-/min左右，效果;柱內徑為3 mm時，流速在
。.5 mL·min左右，效果
為 了確 定 *的色譜條件，先將不含黃曲霉毒素M,的陰性樣品提取液注人HPLC，然后再注
人樣品提取液與黃曲霉毒素M 標準溶液的混合液
1.7.5.2 色譜性能
標準 曲 線 的線性度和色譜系統的穩定性需要經常檢查，多次反復地注人固定量的黃曲霉毒素M,
標準溶液，直至獲得穩定的峰面積和峰高。相鄰兩次峰面積和峰高的差異不得超過5%e
黃曲 霉 毒 素M，的保留時間與溫度有關，所以對測定系統的漂移需要補償。每隔一段時間測定固
定量的黃曲霉毒素M，標準溶液，這些標準溶液的測定結果可以根據漂移的情況進行校正。
1.7.5.3 黃曲.毒索M:的標準曲線
根據 HP LC進樣環容積，選擇適當體積數V,，分別注人含有。.05n g,0.1 n g,0.2n g和0.4 n g的
黃曲霉毒素M 標準溶液。繪制成峰面積或峰高對黃曲霉毒素M,質量數的標準曲線。
1.7.5.4 樣品洗脫液的色譜分析及進樣方案
通過 進 樣 環將適量體積V.洗脫液注人液相色譜儀。采用與標準溶液相同的色譜條件分離出
洗脫液中的黃曲霉毒素M,。標準溶液和樣品洗脫液均按照規定的方案進樣。當連續檢測一系列樣品
時，建議每隔五個樣品，加測一個黃曲霉毒素M,標準溶液。
根 據 樣 品洗脫液色譜圖中黃曲霉毒素M,的峰高或峰面積值，從標準曲線上得出樣品洗脫液中所
含有的黃曲霉毒素M 質量數(ng).
如果 樣 品 洗脫液的黃曲霉毒素M,的峰面積或峰高值高于標準溶液，用水定容稀釋樣品洗脫液后，
重新進樣分析。
1.8 測定結果的計算與表示
1.8. 1 乳
應用 式 ( 2)計算被測樣品中的黃曲霉毒素M,的含量wme
wm = M nX ( V, /V )X ( 1/ V) ··· ··· ··· ···· ··· ···· ··· ···· ? ? (2 )
式 中 :
w一 下 黃 曲霉毒素M的含量，單位為微克每升(Pg/1.);
MA - 一 樣品洗脫液黃曲霉毒素M 的峰面積或峰高從標準曲線上得出的黃曲霉毒素M 的質量
數， 單 位 為納 克 ( ng );
V; 止 樣 品洗脫液的體積數，單位為微升(f4L);
V -一 樣 品洗脫液的zui終體積數，單位為微升(川_);
V- 一 通 過 免 疫親和柱被測樣品的體積數，單位為毫升(ML)o
計 算結 果 表示到小數點后三位。
1.8.2 叨姍
應用式(3)計算被測樣品中的黃曲霉毒素M，的含量woo
w。二m X(v/v.)X (1/m) ···························??(3)
w=C'l-p- 樣品中的黃曲霉毒素M，的含量，單位為微克每千克((lg/kg);
50 ml樣液(7.4)中所含有的乳粉質量數，單位為克(g);
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mn ,V,,vi的含義與1.8.1中所定義的一樣。
式( 3)適用于未經稀釋的試樣，否則應該乘以稀釋倍數。
計 算結果表示到小數點后三位。
9 精密度
各 實驗室試驗結果的精密度總結于附錄A中，這些數據不適用于其他的濃度范圍和材質。
10 測試報告
測 試報告中應該含有:
a) 描述樣品完整特征所需要的所有信息;
b) 采樣方法，如果知道請寫上;
。) 根據該標準，所采用的試驗方法;
d) 該標準沒有提出的其他操作細節，對測試結果可能產生影響的操作、現象以及采取的措施
e) 測試結果;
f) 如果檢查了重復性，zui終的驗證結果。
2 免疫親和層析凈化熒光光度法
盡
21 范圍
本方 法 規 定了用免疫親和層析凈化熒光光度法測定乳和乳粉中黃曲霉毒素M,的條件和詳細分析
步 驟。
本 方 法 適 用 于乳和乳粉中黃曲霉毒素M 的快速測定。乳中黃曲霉毒素M:的檢出限為
0. 1 pg/L，乳粉中黃曲霉毒素M，的檢出限為。.l pg/kgo
22 方法提要
試樣 經 過 離心、脫脂、過濾后，濾液經過含有黃曲霉毒素M,特異性單克隆抗體的免疫親和層析凈
化，黃曲霉毒素M，交聯在層析介質中的抗體上。此抗體對黃曲霉毒素M,具有專一性，當樣品通過親
和柱時，抗體選擇性的與所有存在的黃曲霉毒素M (抗原)鍵合。用甲醇一水(10+90)將免疫親和柱上
雜質除去，以甲醇一水(80+20)通過免疫親和柱洗脫，加人澳溶液衍生后的洗脫液于熒光光度計中測定
黃曲霉毒素M，含量。
23 試劑
除非 另有 規定，僅使用分析純試劑、重蒸餾水。
2.3. 1 甲醇(CH,OH):色譜純。
2.3.2 抓化鈉(NaCI),
2. 3. 3 甲醇一水(10+90):取10 mL甲醇加人90 ml_水
2.3 .4 .甲醇一水(80+20):取80m L甲醇加人20m L水。
2.3.5 澳溶液儲備液(0.01%):稱取適量澳，溶于水后，配成。01%的儲備液，避光保存。
2.3.6 嗅溶液工作液(0.00200):取10m L0 .01 %的嗅溶液加人40m l水混勻，于棕色瓶中保存備用
現用現配。
2.3.7 二水硫酸奎寧(C,oH z,N zO z·H2S 04·2H20).
2.3. 8 硫酸溶液(0.05 m ol/L):取2.8m l濃硫酸，緩慢加人適量水中，冷卻后定容至10 00m l。
2.3. 9 熒光光度計校準溶液:稱取0.34 0g 硫酸奎寧(C2oH 24N 20 2·H2S認·2H20)，用0.05m ol/L
硫酸溶液溶解并定容至100m L，此溶液熒光光度計讀數相當于2.0 p g/L黃曲霉毒素M,標準溶液。
0.05 m ol/I硫酸溶液熒光光度計讀數相當于0.0 F ag/l黃曲霉毒素M-
2.4 儀器
2.4. 1 熒光光度計
2.4. 2 離心機:離心力不低于40 00r /min
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2.4.3 玻璃纖維濾紙:直徑11 cm，孔徑1.5 pme
2.4.4 黃曲霉毒素M，免疫親和柱。
2.4.5 空氣壓力泵。
2.4.6 玻璃試管:直徑12 mm.長75 mm，無熒光特性。
2.4. 7 玻璃注射器。
2.5 分析步甄
2.5. 1 樣品提取
2.5.1.1 乳
取 50 m L乳樣品，加人1.0 g 抓化鈉，40 00r /min離心力下離心10m in，小心移取用于分析的乳底
層脫脂部分，不要擾動頂部脂肪層，將脫脂的乳以玻璃纖維濾紙過濾，濾液備用。
2.5.1.2 乳粉
稱取 5.0 g 乳粉，用30`C^ -60℃水將其慢慢溶解，定容為50m L，加人1.0 g 抓化鈉，以下按
2.5.1.1的步驟操作。
2.5.2 凈化
將免 疫 親 和柱連接于10m L玻璃注射器下。準確移取10.0 m L上述濾液注人玻璃注射器中，將空
氣壓力泵與注射器連接，調節壓力使溶液以約6 mL/min流速緩慢通過免疫親和柱，直至2 mL-3 mL
空氣通過柱體。以10 mL甲醉一水(10+90)清洗柱子兩次，棄去全部流出液，并使2 mL-3 mL空氣通
過柱體。準確加人1.0 rnL(V,)甲醇一水(80十20)洗脫液洗脫，流速為1 mL/min-2 mL/min，收集全部
甲醉一水洗脫液于玻璃試管中，備用。
2.5.3 測定
2.5.3. 1 熒光光度計校準
在激 發 波 長360n m.發射波長450n m條件下，以。.05m ol/1硫酸溶液為空白，調節熒光光度計的
讀數值為0.0 la g/L;以熒光光度計校準溶液調節熒光光度計的讀數值為2.0 la g/L,
2.5.3.2 樣液測定
取上 述 洗 脫液加人1.0m L(V)0.002%澳溶液，1m in后立即于熒光光度計測定樣液中黃曲稱毒素
M，含量c,
2.5.3.3 空白試驗
用 水 代 替試樣，按2.5 .1^-2.5 .3 步驟做空白試驗。
2.6 結.計算
2.6. 1 乳
乳檢 測 結 果按式(4)計算:
X,= (c，一Co) XV,X10
V · ·. ······。，·····..·····.··??(4)
式中:
X,-一試樣中黃曲霉毒素M，含量，單位為微克每升(pH/L);
cl-— 熒光光度計中讀取的樣液中黃曲霉毒素M:的濃度，單位為微克每升(K4/L);
ca-- 熒光光度計中讀取的空白試驗中黃曲霉毒素M:的濃度，單位為微克每升(KB/L);
V,-— zui終凈化甲醇一水洗脫液體積，單位為毫升(mL) ;
V--一通過親和柱試樣體積，單位為毫升(mL) ;
10一一儀器的讀數系數。
計算結果表示到小數點后一位。
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2.6.2 乳粉
乳粉 檢 測 結果按式(5)計算:
X，二
(c2一CO X V, X 10
仇義V ··················。·········? ?(5)
式中:
Xz— 試樣中黃曲橄毒素M、含量，單位為微克每千克(Fig/kg);
ci- 熒光光度計中讀取的樣液中黃曲霉毒素M、的濃度，單位為微克每升如g/L;
ca- 熒光光度計中讀取的空白試驗中黃曲霉毒素M,的濃度，單位為微克每升伽g/L);
叭— zui終凈化甲醉一水洗脫液體積，單位為毫升(mL;
V— 通過親和柱試樣體積，單位為毫升(mL) ;
m- 50 mL試樣中所含乳粉的質量數，單位為克每毫升(g/mL) ;
10— 儀器的讀數系數。
計算結果表示到小數點后一位。
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附 錄 A
(資 料 性 附 錄 )
多個不同實驗室的試驗結果
世 界各 地 16個實驗室參加了低脂肪(I%)和高脂肪(28 )乳粉樣品的協同試驗。高脂肪樣品是用
于制作參比物質的剩留物[4口，所以黃曲霉毒素M,的含量是已知的。
對于 乳 粉 ，其污染水平為。08p g/kg--0.6 p g/kg，即對于乳而言，污染水平為8n g/L-60n g/I.
試驗 結 果 根據ISO 5725-1和ISO 5725-2仁2;3〕規定的統計方法獲得，其精密度的數據列于表A.1
(注:試驗數據來自于參考文獻「5〕和「6]).
表 A .1 箱 密 度 數 據
樣品編號1 2 3 4 5
實驗室個數12 4 l3 11 14
平均值/(ng/kg) 81 150 80 202 580
重復性值。/(ng/kg) 23 60. 1 15 27 203
再現性值R/(ng/kg) 52 98 41 61 310
重復性變異系數/(%) 9. 9 14.0 6. 8 4. 7 12. 5
復驗性變異系數/(寫) 23 22. 7 18. 3 10.8 19. 1
減少的實驗室數是根據Cochran和Grubbs統計方法應該從樣本中剔除的數據
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